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    伯豪生物
    單細胞 TCR/BCR 測序
    伯豪生物新官網消息

    技術簡介

    免疫組庫(Immune Repertoire,IR)是指機體內 T 淋巴細胞和 B 淋巴細胞多樣性的總和,反映機體免疫系統在特定時間段內應對外界刺激應答的能力?;?10X Genomics 的單細胞系統,可實現高通量的單細胞轉錄組和 V(D)J 測序。不但可以將 TCR/BCR 雙鏈匹配,而且能夠同時獲得基因表達信息。

    技術原理

    10X Genomic 單細胞免疫組庫測序與單細胞 RNA 測序一樣,通過微流控系統將帶有條形碼和引物的凝膠珠與單個細胞包裹在油滴中;接下來在每個油滴內,凝膠珠溶解,細胞裂解釋放 mRNA,通過逆轉錄產生帶有 10X barcode 和 UMI 信息的 cDNA。破油(Breaking Emulsions)之后,cDNA 一分為二,后續同時進行基因表達和免疫組庫的文庫構建。其中 TCR 或者 BCR 的 V(D)J 序列通過設計在 C 區的巢式引物進行 PCR 富集;而 mRNA 的信息,與 10X Genomics 3’mRNA 文庫不同,保留的是 5’端的信息。測序后即可一次性獲得大量單細胞的基因表達和免疫組庫數據。

     

    圖 5’mRNA 與 TCR/BCR 同時建庫

     

    伯豪優勢


    1、通量高:一張芯片具有 8 個獨立的通道,可供 8 個樣本同時上機,每個通道可捕獲 10000 個細胞。

    2、分辨率高:可獲得真正單細胞水平的的免疫組庫信息,并且可匹配 TCR/BCR 的雙鏈。

    3、信息豐富:可同時獲得單個細胞匹配的 mRNA 和 TCR/BCR 信息。


    文庫結構

    5’gene expression 文庫


    圖 10X Genomics 5’gene expression 文庫示意圖

     

    V(D)J 文庫


    圖 10X Genomics V(D)J 文庫示意圖

     

    建議測序深度及參數

    指標

    參數

    測序深度 -5’mRNA

    50,000~100,000 reads/cell

    測序深度 -TCR/BCR

    5,000~10,000 reads/cell

    測序類型

    PE150

    樣本要求

    1、類型:新鮮組織,原代細胞,細胞系等。

    2、來源:血液提取、磁珠富集、流式富集、組織解離等。

    3、樣本量及其它質控要求:

    樣本類型 要求
    細胞懸液 > 10* 目標細胞個數(底限 10,000 個細胞);
      活率 >80%;
    濃度 500-1,000 個細胞 /ul;
    細胞間無粘連(成團率 <5%);
    無大于 40um 的細胞碎片或其他顆粒物;
    不存在逆轉錄抑制劑和非細胞的核酸分子。
    血液 EDTA 抗凝的全血(不可肝素抗凝),>5ml。
    組織 0.3cm × 0.3cm(不超過 0.5 × 0.5cm)的新鮮組織,4~5 塊。


    4、樣本的保存與運輸


    樣本類型 要求
    細胞懸液 建議現場制備,如要運輸,建議使用伯豪生物自主研發的單細胞保護液,4°C 運輸,48 小時內送達伯豪生物實驗室。
    血液 EDTA 抗凝的全血,4°C 運輸,2 小時內送達伯豪生物實驗室;或提取 PBMC 后凍存,干冰運輸。
    組織 建議使用伯豪生物自主研發的單細胞組織保護液,4°C 運輸,48 小時內送達伯豪生物實驗室。

    應用領域

    1、腫瘤微環境;

    2、自身免疫性疾??;

    3、感染性疾??;

    4、器官、骨髓移植;

    5、抗體開發。


    案例展示


    1、肝癌免疫微環境

    2017 年,北京大學張澤民教授課題組通過大規模單細胞測序技術對肝癌相關 T 淋巴細胞進行了分析,在單細胞水平上描繪肝癌微環境中免疫圖譜。研究者收集了 6 例肝癌患者的外周血,癌旁正常組織、肝癌組織作為實驗樣本,然后從各類樣本中用流式分選出 CD3+CD8+(cytotoxic T cells,Tc)細胞,以及 CD4+CD25-(Helper T cells,Th)細胞和 CD4+CD25+(regulatory T cells,Tregs)細胞,并進行了單細胞轉錄組測序和單細胞 TCR 測序,總共獲得 5063 個單細胞的數據。其中,單細胞水平分析 TCR 序列發現,在腫瘤侵潤的 exhausted T 細胞和 Tregs 細胞中,觀察到 TCRs 發生了重復使用。在腫瘤組織中含有相同 TCR 的 T 細胞比例較高,而在外周血和正常組織中比例較低,這說明在腫瘤中的 exhausted T 細胞和 Tregs 細胞發生了克隆擴增。并且相比于早期病人,晚期病人中 T 細胞的克隆擴增更加明 顯。


    圖 肝癌中 T 細胞的克隆擴增

     

    2、黑色素瘤免疫微環境

    2019 年發表在 Cell 上發表的一篇論文,對 25 個黑色素瘤患者腫瘤中總共 46,621 個免疫細胞進行了單細胞 RNA 和 TCR 測序。這些細胞被分成 7 個大群,包括 T 細胞(CD3),NK 細胞(KLRD1),樹突細胞(DCs;CD1C),巨噬細胞(C1Q),單核細胞(VCAN),B 細胞(CD19),和漿細胞(immunoglobulins)。初始 T 細胞高表達 IL7R, CCR7 和轉錄因子 TCF7,特異性表達的基因整體來說比其它類型的細胞少。而非初始 T 細胞具有很高的異質性,其中一小群是記憶 T 細胞,大部分細胞是過渡性 CD8 T 細胞(transitional CD8 effector T),細胞毒性 CD8 T 細胞(cytotoxic CD8 effector T)和喪失功能的 CD8 T 細胞(dysfunctional CD8 T cells),高表達 PD- 1 和 LAG3。這些細胞類群的邊界是模糊的,提示轉錄的梯度表達是造成 T 細胞異質性的原因。CD4 T 細胞主要有高表達 FOXP3 的 Treg,濾泡輔助 T 細胞(CXCL13 表達),以及一小群高表達免疫檢查點分子的細胞(dysfunctional CD4 T cells)。分析每名患者的免疫細胞組成,發現大部分 T 細胞類群在患者中都存在,但是病人之間不同細胞類群的豐度有很大差異。喪失功能的 CD8 T 細胞的負荷可能是黑色素瘤本質的特征。


    圖 病人間免疫微環境異質性

    通過分析 T 細胞的 TCR 序列,發現不同病人的 TCR 克隆型構成差異較大。一些大的克隆中細胞類型也不同,主要表現為喪失功能的 CD8 T 細胞的富集和初始 T 細胞的缺失?;颊咧袉适Чδ艿?CD8 T 細胞的比例與 T 細胞的擴增程度呈現正相關。通過計算每個細胞的增殖分數,發現喪失功能的 CD8 T 細胞有高增殖細胞比例,比初始 T 細胞高出 10 倍。


    圖 黑色素瘤中 T 細胞的克隆擴增


    3、免疫治療

    靶向 PD-1/PD-L1 通路的免疫檢查點抑制劑的出現,給癌癥的臨床治療帶來了革命性的變化。然而 人們對 PD-1 抗體的抑癌機制并不了解。其中一個關鍵的問題是 PD- 1 抗體的抑癌效果,究竟是依賴于在治療前就存在于腫瘤中的浸潤淋巴細胞的再激 活,還是治療之后,腫瘤外的殺傷 T 細胞進入腫瘤?這個問題,目前也是不清楚的。來自斯坦福大學醫學院的研究團隊,從接受 PD- 1 抗體治療前后的基底細胞癌(BCC)或鱗狀細胞癌(SCC)患者身上采集了 79046 個細胞(包括癌細胞和各種免疫細胞),進行了單細胞 RNA 測序和 TCR 測序?;趩渭毎?RNA 測序結果,細胞分成 19 個亞群。

    本研究的重點是免疫細胞,尤其是浸潤性免疫細胞,以及治療前后的變化,以了解克隆性 T 細胞對 PD- 1 抗體治療的反應。因此研究人員把所有的 33106 個腫瘤浸潤性 T 細胞做了個更細致的分類,包括表達 CD4 的調節性 T 細胞(Treg)細胞,濾泡輔助性 T(TFH)細胞,T 輔助細胞 17(TH17)細胞;以及表達 CD8 的幼稚細胞,記憶 T 細胞,效應記憶 T 細胞,活化 T 細胞,慢性活化 / 耗竭 T 細胞,中度耗竭 / 活化細胞。進一步分析發現,在 PD- 1 抗體治療之后,濾泡輔助性 T 細胞,以及活化,耗竭和耗竭 / 活化的 CD8 陽性 T 細胞的頻率增加,并且耗竭 T 細胞的克隆水平明 顯更高。更為讓研究人員感到意外的是,對于同一個患者而言,治療后記憶 T 細胞和效應 T 細胞頻繁轉換為活化狀態,但是治療前的耗竭 T 細胞卻沒有變成治療后的非耗竭表型。這表明,即使在 PD- 1 抗體治療后,已經耗竭的腫瘤浸潤 T 細胞也很難變成活化狀態了。


    圖 治療前后 T 細胞的狀態轉換。

    此外,研究人員還觀察到一個有趣的現象,PD- 1 抗體治療后才出現的耗竭性 T 細胞表現出了新的 TCR 特異性。為了分析外周血中是否存在新發現的腫瘤浸潤性 T 細胞,研究人員給患者的血液樣品做了 TCR 測序,發現 35.5% 新腫瘤浸潤性 T 細胞可以在 PD- 1 抗體治療后的外周血中找到,而在治療前的外周血中只能找到 11.8% 的新腫瘤浸潤性 T 細胞,不過治療前的腫瘤里面卻沒有新腫瘤浸潤性 T 細胞。


    圖 新發現的腫瘤浸潤性 T 細胞在外周血中的比例

    總的來說,與“冷”腫瘤相比,“熱”腫瘤之所以響應 PD- 1 抗體的治療,可能是由于“熱”腫瘤自身的特性,讓它能夠不斷吸引新 T 細胞進入,而不是重新激活已有的腫瘤浸潤性 T 細胞。這項研究讓我們對免疫檢查點抑制劑的作用機制有了新的認知,這對臨床治療和療效的檢測都有一定的價值和意義。


    -END-


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