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    伯豪生物
    伯豪生物 | 新藥研發 & 疫苗研發整體解決方案
    發布時間:2021-08-12 瀏覽次數:1749
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    技術背景

    2018 年以來,越來越多的藥物研發機構開始注意到單細胞測序技術在藥物研發上的優勢。首先是通過分析不同病人樣本的單細胞圖譜來挖掘潛在的靶點(細胞、通路和分子),主要是在 RNA 和蛋白水平上篩選及驗證細胞特異性表達的藥物靶標。其次,探究病人組織微環境中細胞類型與分子特征的相關性,如靶標與特定的免疫細胞或基質細胞、信號通路、空間位置、受體配體等的相關性,從而更好地確定靶標的作用方式及細胞 - 細胞相互作用。一旦確定了靶點,需將候選模型與病人的單細胞表達譜進行比較,以確定匹配的模型。并且單細胞測序還能用于進一步探究細胞構成及基因表達在用藥前后的變化,及治療有效 / 無效之間的差異,以評估治療過程及新藥物的有效性;此外,對不同藥物及其組合進行單細胞測序比較,還可篩選治療組合。


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    為什么 更多科研工作者 選擇 伯豪生物單細胞測序技術服務?

    2020 年,行業首份《單細胞測序行研報告》系伯豪生物編寫、聯合出版;

    2021 年,Bio-protocol  單細胞測序技術實驗方法復現集系伯豪生物聯合出版;

    ●大樣本量驗證:30 萬樣本 / 年,伯豪專業技術服務團隊實驗經驗豐富;

    ●嚴格質量標準:QA 系統為您實驗全程護航,實驗嚴格按照 156 個 SOP 文件進行;

    ●實驗記錄完備: 嚴格的流水線作業項目管理流程,保證所有實驗記錄可供回溯;

    ●多重實驗質控: 實驗室 QC、數據分析 QC、項目管理 QC,3 重 QC 有效減少低質量數據。


    伯豪生物 單細胞測序技術 能夠應用到哪些領域?

    單細胞測序技術以其高通量、高分辨率的特點,使人們開始意識到它在藥物研發中的巨大潛力,包括在單細胞水平上進行高通量地藥物靶點篩選、藥代動力學分析、藥效評價等,極大地縮減藥物發現周期、節約新藥研發成本。單細胞測序技術為新藥研發注入新的希望,有助于藥物研發機構優化新藥研發管線。

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    ▲驅動藥物開發的單細胞測序技術




    在臨床前或臨床試驗中,單細胞表達譜的分子分辨率可用于描述聯合免疫治療中潛在的協同、加性、中性或拮抗的細胞和分子活性。三陰性乳腺癌(TNBC)是一種常對化療產生耐藥性的惡性乳腺癌,這種耐藥性是由于化療對預先存在的克隆的選擇還是化療期間獲得了新的基因突變導致是一個長久未解決的問題。為了探究這個問題,科學家們利用單細胞 RNA-seq、單細胞 DNA-seq 和全外顯子測序研究了 20 名 TNBC 患者在接受新輔助化療(NAC)期間的基因及表達變化,相關研究成果 2018 年發表在《Cell》上 [6]。


    深度外顯子測序發現 10 位患者 NAC 導致 clone 消失,而 10 位患者治療后 clone 一直存在,利用單細胞基因組測序探究拷貝數變異,鑒定耐藥基因。對不同治療時期的腫瘤細胞進行差異表達基因分析發現,所有消退型患者在治療后 12 個已知的癌癥基因均下調,部分信號通路也下調。結合分析腫瘤細胞和正常細胞,發現治療后正常細胞亞群中 ACTA2 表達水平高,治療前腫瘤細胞亞群中 EPCAM 表達水平高。探究持續型患者的表型進化,對每個患者進行差異表達分析,僅有少量顯著基因(MYC,ERBB3,KIT,PI3KR1)已知與腫瘤相關,但耐藥基因在治療后出現了高度富集。

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    ▲圖 治療與腫瘤表型進化相關性(消退型患者)[6]

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    ▲圖 治療與腫瘤表型進化相關性(持續型患者)[6]

    引用文獻:

    [6] Kim C, Gao R, Sei E, et al. Chemoresistance Evolution in Triple-Negative Breast Cancer Delineated by Single-Cell Sequencing[J]. Cell, 2018, 173(4):879-893.



    案例 1:病毒疫苗


    謝曉亮教授團隊利用高通量單細胞 RNA 和 VDJ 測序平臺,從 60 位康復期病人身上篩選出 8558 種病毒蛋白結合抗體序列,成功找出 14 株高活性的中和抗體。其中編號為 BD-368- 2 的抗體表現突出,在假病毒實驗中的半抑制濃度(IC50)達到 1.2 ng/mL(8pM);在軍事醫學研究院 P3 實驗室進行的真病毒實驗中,IC50 達到 15 ng/mL(100pM)。中和抗體體內抗病毒實驗進一步證實,利用 hACE2 轉基因小鼠模型,感染 SARS-Cov- 2 后給予 BD-368- 2 的治療使病毒載量下降~2400 倍。而注射 BD-368- 2 后可完全抑制小鼠的病毒感染,達到預防效果。研究團隊還利用冷凍電鏡得到新冠病毒 Spike 三聚體與中和抗體的高分辨率 3.8?三維結構密度圖。數據顯示,抗原上的中和抗體表位與 ACE2 的結合位點重合,從而揭示出中和作用的結構基礎。此外,研究人員還證明了可以根據 CDR3H 結構的相似性來選擇 SARS-CoV- 2 中和抗體 [7]。

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    ▲圖 利用高通量單細胞 RNA 和 VDJ 測序篩選中和抗體


    案例 2:病毒疫苗


    范德比爾特大學的研究組在 Cell 雜志上發表文章 [8],提出了一種名為 LIBRA-seq 的新的測序技術。作者構建了一個特殊的抗原庫,將抗原連接上 DNA 條碼和用于流式細胞術分選的熒光標簽。接下來,將這個庫與富含 B 細胞的樣本共孵育。將連有熒光標簽的抗原和與之結合的 B 細胞共同分選出來,并進行測序,從而得到 BCR- 抗原序列圖譜。利用 LIBRA-seq,研究人員繪制了來自兩名 HIV 感染者的數千個 B 細胞的抗原特異性圖譜,許多 HIV 和流感特異性抗體的預測特異性得到證實。這項技術可以有效地繪制 BCR 序列及其對應的特異性抗原圖譜,在抗體研發和疫苗制備領域具有廣泛的應用。

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    ▲圖 LIBRA-seq 及功能驗證流程


    案例 3:個性化腫瘤疫苗


    NeoVax 是一種新抗原(Neoantigen)腫瘤疫苗,主要以新抗原為靶點。新抗原通常是腫瘤細胞在發生發展過程中,隨機突變產生的新的蛋白質或多肽,一般特異性表達于腫瘤細胞中但不存在與正常組織細胞中。因此,新抗原也成為了腫瘤免疫治療的理想靶點。早在 2017 年,美國 Dana Farber 癌癥研究所應用 NeoVax 治療惡性黑色素瘤患者,并取得的良好療效。6 名高復發風險的患者在術后 18 周開始接受 NeoVax 疫苗治療。在接種后的 2 年多時間內,4 名患者未發現腫瘤復發;另外 2 名惡性黑色素瘤伴肺轉移的患者,在接種疫苗后復發,隨即開始接受 PD-1 單抗藥物的治療,也獲得完全緩解并處于無疾病進展狀態 [9]。為了進一步探究 NeoVax 腫瘤疫苗的遠期臨床療效及其機制,研究人員對上述 6 名患者及新入組的 2 名患者進行長期隨訪。在術后 4 年多(55 個月)的中位數隨訪中,8 名患者全部存活,其中 3 名患者仍未出現復發。復發的 5 名患者中,2 名 IV 期患者接受 pembrolizumab(PD- 1 單抗)治療后完全緩解(2017 年已報道),1 名患者接受了手術切除且仍未發現疾病證據(NED),2 名患者發展為不可切除的轉移性疾病。

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    ▲圖 新抗原疫苗治療的黑色素瘤患者的長期臨床結果


    對于如此令人興奮的長期臨床療效,研究人員期望揭示患者體內的變化和機制。研究人員首先試圖確定 NeoVax 疫苗誘導的特異性 T、細胞在外周血中的功能狀態是如何演變的。他們對新抗原特異性 T 細胞,尤其是 CD4+ T 細胞的特征進行了跟蹤和分析。結果發現,NeoVax 疫苗誘導的新抗原特異性 CD4+ T 細胞表現出記憶性和細胞毒性特征。進一步分析了這些患者的 T 細胞,發現這些患者體內不僅產生了靶向的目標新抗原的特異性 T 細胞,而且還擴展到識別其他與黑色素瘤相關的新抗原,起到了更強更持久的抗腫瘤效果 [10]。

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    ▲圖 抗原特異性 T 細胞的跟蹤和分析


    引用文獻:

    [7]. Yunlong Cao, Bin Su, Xianghua Guo, et al. Potent Neutralizing Antibodies against SARS-CoV-2 Identified by High-Throughput Single-Cell Sequencing of Convalescent Patients’B Cells[J]. Cell, 2020, 182(1):73-84.

    [8]. Setliff I, Shiakolas A R, Pilewski K A, et al. High-Throughput Mapping of B Cell Receptor Sequences to Antigen Specificity[J]. Cell, 2019, 179(7):1636-1646.

    [9]. Ott PA, Hu Z, Keskin DB, et al. An immunogenic personal neoantigen vaccine for patients with melanoma[J]. Nature, 2017, 547(7662):217-221.

    [10]. Zhuting Hu, Donna E Leet, Rosa L Alles?e, et al. Personal neoantigen vaccines induce persistent memory T cell responses and epitope spreading in patients with melanoma[J]. Nature Medicine, 2021, 27(3):515-525.

     

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