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    伯豪生物
    伯豪生物 | 外泌體組學研究整體解決方案
    發布時間:2019-12-11 瀏覽次數:5751
    外泌體(exosomes)是由多種細胞分泌的直徑約30~150nm的小囊泡,由細胞內多泡體(MVBs)出芽形成,與細胞膜融合后釋放到細胞外基質中[1]。外泌體富含蛋白質、脂質、DNA和各種RNA(miRNA、lncRNA、circRNA、mRNA等),不同細胞來源的外泌體在不同的生理和病理條件下所含有的具體成分不盡相同,血液、尿液、羊水、乳汁、腹水等動物體液來源的外泌體通常含有特定的RNA和蛋白質,能夠反映生物體的健康或疾病狀態。外泌體廣泛存在并分布于各種生物體液中,通過細胞間的通訊將重要的信號分子傳遞給其他細胞,這種細胞間的傳遞活動在人類的發育、免疫、組織穩態、神經退行性疾病和腫瘤等多種健康與疾病領域起著重要的調節作用,尤其在腫瘤方面,腫瘤細胞以高水平釋放外泌體,這些外泌體作為天然載體,將腫瘤相關因子遞交給相鄰或遠處的靶細胞,促進腫瘤的生長和轉移,重塑腫瘤微環境。因此,外泌體是研究各種疾病潛在biomarker的良好生物學材料,將外泌體RNA作為潛在的biomarker和治療靶點,也越來越受到科學家們的重視。

    伯豪生物外泌體組學研究整體解決方案


     

    外泌體的形成與分泌

    外泌體整體服務流程

    外泌體可以作為腫瘤 biomarker、治療靶點,具有重要的臨床意義,研究前景十分廣闊。伯豪生物基于豐富的外泌體項目經驗,摸索出了一套完整而穩健的外泌體分離、鑒定、內含物檢測及驗證的方法,已經助力多名客戶在包括《Nature cell biology》在內的國際一流期刊上發表高分文章。目前我們整合高標準的樣品處理平臺、微陣列芯片平臺、高通量測序平臺、生物標志物平臺、生物信息平臺等多個平臺,優化資源配置,真正使您的樣本在各個階段的處理流程中實現無縫式連接,致力于為您提供外泌體研究的“一站式”服務。


    分離

    外泌體獨特的生物學特征,使得對其結構、組成和功能的探索已經成為生物研究領域的焦點和熱點,而其與多種疾病密不可分的關系,尤其是在腫瘤方面,使得其與人們的日常生活關系更加緊密,對外泌體進行相關研究的首步就是外泌體的分離,目前外泌體的分離方法多種多樣,其中使用率多的是超速離心法和試劑盒抽提法。

     

    超速離心法

    超速離心法是常見的傳統外泌體分離技術之一,依據外泌體與其他微小囊泡密度和大小的不同而分離。通過逐步提高離心速度,可有效去除細胞、細胞碎片和大囊泡,收集高純度的外泌體。超速離心法操作簡單,獲得的外泌體數量較多,是研究者常用的外泌體分離純化手段,被廣泛應用于血清、血漿、細胞上清、尿液、唾液和腦脊液等各類生物樣品外泌體的分離。


    伯豪生物擁有專業的外泌體實驗團隊,豐富的外泌體超離經驗,已成功從細胞上清、尿液、血清、血漿中提取到高純度的外泌體,我們在經典超離方法上不斷優化,確保外泌體純度的同時提供得率和穩定性。

     

    SBI 外泌體抽提試劑盒

    聚合物沉淀法是目前第二大主流的外泌體分離技術,其中常見的聚合物是聚乙二醇(PEG)。SBI(System Biosciences)公司的外泌體提取試劑盒基于 PEG 沉淀法,能夠快速有效地提取血清、血漿、細胞上清及其他生物體液中的外泌體。該試劑盒的原理是通過聚合物和水分子的結合形成類似于網狀的結構,將包括外泌體在內的不溶性物質分離出來,隨后利用低速離心法棄上清收集得到外泌體。

     

    SBI 外泌體抽提試劑盒是目前使用率高的商品化外泌體抽提試劑盒,該試劑盒適用于提取任何種屬來源的生物體液外泌體,可從 100ul 血清或 5ml 細胞培養上清 / 尿液中分離外泌體,省時省力的同時能夠保持外泌體的完整形態和生物活性。

    鑒定

    現有的外泌體分離技術主要是根據外泌體的大小、結構和一些膜蛋白的捕獲,很難將其與其他囊泡和大分子蛋白復合物完全區分開,因此就需要對分離得到的外泌體進行鑒定,以確定分離得到的就是外泌體。目前外泌體的鑒定主要依賴于其形態特征(透射電鏡 TEM)、粒徑與濃度(納米顆粒跟蹤分析 NTA)、標志性蛋白(蛋白質印跡技術 WB)。

    透射電子顯微鏡(TEM)

    由于外泌體的直徑較小,一般在 30~150nm 之間,傳統的光學顯微鏡無法識別,而透射電子顯微鏡(Transmission Electron Microscopy,TEM)可以直觀地觀察到外泌體的形態和大小,有效識別外泌體。目前電鏡觀察是鑒定外泌體直接的方法,電鏡下的外泌體大小不一,通常呈茶托樣的圓形或橢圓形。

     

    伯豪生物采用 FEI 公司的 Tecnai G2 Spirit 透射電子顯微鏡進行外泌體形態觀察,該透射電鏡具有高對比度,高分辨率成像和分析系統,獨特的 Biotwin 物鏡系統能夠提供好的圖像襯度。


    納米顆粒跟蹤分析(NTA)

    納米顆粒跟蹤分析(Nanoparticle Tracking Analysis,NTA)技術的原理是對每個納米顆粒的布朗運動進行追蹤和分析,結合 Stockes-Einstein 方程式計算出其粒徑和濃度。NTA 技術樣本處理簡單,檢測速度快,已被外泌體研究領域認可為鑒定外泌體表征的主要手段之一。

     

    Particle Metrix 公司推出的納米顆粒跟蹤分析儀 ZetaView,結合經典微電泳技術和布朗運動對單個顆粒進行跟蹤分析,其具有自動校準和自動聚焦功能,利用分析軟件 ZetaView 8.04.02 可以計算出每個顆粒的粒徑和濃度。

    檢測

    伯豪生物擁有豐富外泌體蛋白及 RNA 檢測分析經驗,外泌體蛋白方面,蛋白質譜和抗體芯片兩大技術平臺,能夠滿足客戶對外泌體蛋白的不同研究需求,外泌體 RNA 方面,成熟完善的 RNA 芯片平臺、RNA 測序平臺及數字 PCR 平臺同樣能夠滿足客戶對外泌體 RNA 的不同研究需求,尤其在 RNA 方面,伯豪生物已經助力客戶在 nature cell biology 等雜志上發表多篇外泌體 RNA 研究的高分文章。

     

    外泌體蛋白檢測

    蛋白質譜:將質譜儀用于研究蛋白質,適用于尋找廣泛類型外泌體差異蛋白譜,在膜蛋白篩選上優勢明顯。

    抗體芯片:充分結合了生物芯片高通量的優點和抗原 / 抗體反應敏感性和特異性的原理,實現了蛋白質表達水平的高精度高通量篩選。

    Simoa 超靈敏蛋白檢測:靈敏度相較于傳統 ELISA 平均提高了近 1000 倍,實現數字化形式的 ELISA 檢測。


    外泌體 RNA 檢測

    RNA 芯片:Shbio ceRNA 芯片、Shbio circRNA 芯片、Shbio lncRNA 芯片及 miRNA 芯片能夠滿足對外泌體非編碼 RNA 的檢測需求,Agilent 和 Affymetrix 的表達譜芯片能夠滿足對外泌體 mRNA 的檢測需求。

    RNA 測序:全轉錄組測序能同時檢測 circRNA、lncRNA、mRNA,small RNA 測序能同時檢測 miRNA、piRNA、內源性 siRNA 等。

      

    外泌體 RNA 驗證

    數字 PCR:數字 PCR 是一種核酸分子 jué對定量技術,相較于 qPCR,數字 PCR 靈敏度極高,能對起始樣品進行 jué 對定量,非常適合外泌體研究項目。



    經典應用案列

    案例一:  腫瘤微環境

    伯豪生物提供:全轉錄組測序、lncRNA 芯片及數據分析服務 (IF=17.72)


    在整個腫瘤組織的浸潤區,巨噬細胞約占 50%


    在整個腫瘤組織的浸潤區,巨噬細胞約占 50%, 有研究結果表明,巨噬細胞的數量同腫瘤的預后呈負相關,說明了巨噬細胞在腫瘤發展過程中具有重要作用。腫瘤浸潤區巨噬細胞能夠分泌外泌體,本研究著重關注外泌體中 lncRNA 對腫瘤代謝過程的影響。

     

    案例:Chen Fei,Chen Jianing,Yang Linbin et al. Extracellular vesicle-packaged HIF-1α-stabilizing lncRNA from tumour-associated macrophages regulates aerobic glycolysis of breast cancer cells.[J] .Nat. Cell Biol., 2019, 21: 498-510. (IF=17.72)


    本研究通過全轉錄測序及 lncRNA 芯片技術( 全轉錄組測序、lncRNA 芯片及數據分析服務由伯豪生物提供 )對巨噬細胞外泌體來源的 RNA 進行檢測,分析結果顯示腫瘤微環境中發生糖酵解的腫瘤細胞釋放的乳酸,能夠通過反饋調節,上調巨噬細胞釋放的 HISLA,從而維持巨噬細胞來源的外泌體中 HISLA 的高豐度。阻斷外泌體 HISLA 的運輸,能夠抑制乳腺腫瘤的糖酵解反應和化療抗藥性。該研究強調了巨噬細胞釋放的外泌體 lncRNA 作為細胞信號傳導載體的潛力,其在腫瘤微環境中進行細胞間傳遞,調控著腫瘤的代謝活動。

     


    案例二:胃癌

    伯豪生物提供:ceRNA 芯片及數據分析服務(IF=4.98)

     

    癌性惡病質主要是由腫瘤細胞產物及機體釋放的細胞因子引起的以全身代謝紊亂為特征的一種繼發性反應。外泌體通過傳遞 miRNA、蛋白質、lncRNA、circRNA 和 DNA,在介導相鄰或遠端細胞之間的信號轉導中發揮關鍵作用。對胃癌患者的外泌體 circRNA 進行檢測,以期篩選關鍵 circRNA,解析腫瘤惡病質。

     

    案例:Zhang Haiyang,Zhu Lei,Bai Ming et al. Exosomal circRNA derived from gastric tumor promotes white adipose browning by targeting the miR-133/PRDM16 pathway.[J] .Int. J. Cancer, 2019, 144: 2501-2515.(IF=4.98

     

    本研究通過 ceRNA 芯片技術(ceRNA 芯片及數據分析服務由伯豪生物提供 )對胃癌病人血漿外泌體中的 circRNA 進行檢測,研究發現 ciRS-133 的表達與 BAT 的質量以及身體脂肪率呈正相關。外泌體來源的 ciRS-133 可以通過吸附 miR-133 來激活脂肪細胞的 PRFM16/UCP1 途徑,促進 PRDM16 的表達,調節脂肪細胞的代謝活性,進而促進白色脂肪褐變,從而加速腫瘤的惡病質。

     

     

     

    案例三:肝癌

    伯豪生物提供:ceRNA 芯片及數據分析服務(IF=6.63)

     

    肝細胞癌(HCC)是肝癌的主要形式,其發病率高,預后差。已知脂肪組織通過脂肪因子的分泌在能量儲存和代謝調節中起作用。環狀 RNA(circRNA)作為一種新型的非編碼 RNA,近期被認為是腫瘤發展的關鍵因子,但尚未確定源自脂肪組織的外泌體 circRNA 的作用。

     

    Zhang Haiyang,Deng Ting,Ge Shaohua et al. Exosome circRNA secreted from adipocytes promotes the growth of hepatocellular carcinoma by targeting deubiquitination-related USP7.[J] .Oncogene, 2019, 38: 2844-2859. (IF=6.63)

     

    本研究利用 ceRNA 芯片(ceRNA 芯片及數據分析服務由伯豪生物提供 )對具有較高和較低體脂率(BFR)的 HCC 患者外泌體進行了 circRNA 表達檢測,發現外泌體 circ-BD 及陽性 USP7 與 BFR 相關。circ-DB 在脂肪細胞外泌體中高表達,通過吸附 miR-34a 促進 USP7 和細胞周期蛋白 A2 的表達。通過測量腫瘤重量、小鼠體重、體脂率和肝轉移情況,研究發現 circ-DB 是增強 HCC 腫瘤進展的促進者。研究結果認為脂肪來源的外泌體通過調節去泛素化相關的 miR-34a/USP7 通路來介導 circRNA 的遞送并促進 HCC 的腫瘤發生。


    1. Yang Xiao-Xia,Sun Chao,Wang Lei et al. New insight into isolation, identification techniques and medical applications of exosomes.[J] .J Control Release, 2019, 308: 119-129.

    2. Li Changbiao,Xu Xiao,Biological functions and clinical applications of exosomal non-coding RNAs in hepatocellular carcinoma.[J] .Cell. Mol. Life Sci., 2019, undefined: undefined.


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